История создания нового отечественного лекарственного препарата - ТРОМБОВАЗИМ насчитывает более 30 лет. Идея создания препарата, лизирующего некротические массы и фибрин принадлежит коллективу под началом академика РАН, лауреата Государственной и Ленинской премий Р.И.Салганика, когда он возглавлял Отдел молекулярной генетики Института цитологии и генетики Сибирского отделения Академии наук. У истоков создания препарата стоял коллектив ученых, под руководством проф., д.ф-м.н. Ауслендера В.Л. (Институт ядерной физики ) и проф., д.м.н. Гончара А.М. (Институт Цитологии и Генетики СО РАН). С 1975 года начался подбор необходимых ферментов, и технологии иммобилизации биомолекул на водорастворимых полимерах. Как результат сотрудничества биологов, медиков и физиков-ядерщиков впервые для иммобилизации биомолекул на полимерах малой и средней молекулярной массы была использована электронно-лучевая технология.

Созданный на основе радиационного синтеза препарат «Имозимаза» представлял собой иммобилизированные на водорастворимом полимере полиотиленоксиде (ПЭО 1500) бактериальные ферменты, выделенные из Вас. Subtilis BK-17, так называемые субтилизины (ММ 27,5-31 кДа). Субтилизины характеризуются высокой активностю именно к денатурированным и нерастворимым белкам.

Имозимаза как лекарственный препарат показала свою высокую эффективность в лечении раневых процессов, с успехом применялась во многих хирургических стационарах СССР и военно-полевой хирургии (Коган А.С., Салганик Р.И., Семенова Л.А. и др. Иммобилизованные протеолитические ферменты и раневой процесс. Новосибирск, 1983).

Технология создания ферментных препаратов на основе радиационного синтеза получила свое творческое развитие в созданной в начале 2000 годов научно-производственной компании - Сибирский Центр Фармакологии и Биотехнологии. Были отработаны и внедрены оптимальные технологические режимы производства препаратов на основе субтилизинов. У композиции иммобилизованных субтилизинов были выявлены новые свойства - фибринолиз, исчезновение патогенности при системном применении, высокая биодоступность при энтеральном приеме. Открылась перспектива создания не только принципиально новых тромболитиков (именно тромболитиков, поскольку субтилизины растворяют не только фибрин, но и клеточную составляющую тромбов), но и совершенно революционного препарата- энтерального тромболитика с противовоспалительными и репарационными свойствами.

Сегодня Сибирский Центр Фармакологии и Биотехнологии единственная в России фабрика с полным технологическим циклом производства биотехнологических препаратов. Однако это не только производственная площадка, оснащенная самым современным оборудованием, в его состав входит и мощная лабораторная база, где проводятся доклинические исследования и валидация технологических процессов по международным нормам лабораторной и производственной практики.

В настоящий момент, благодаря научно-производственным мощностям СЦФБ создан первый отечественный тромболитик Тромбовазим, который является оригинальным препаратом с уникальными свойствами. Тромбовазим отличается высокой устойчивостью, чистотой, соответствующей самым высоким требованиям, возможностью длительного хранения, и, самое главное, практически полным отсутствием токсических и побочных эффектов.

Глава 1. РАДИАЦИОННАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ НА ПОЛИМЕРАХ КАК СПОСОБ УСТРАНЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ БИОМОЛЕКУЛ

Ранее отмечалось, что иммобилизированные ферменты обладают рядом преимуществ по сравнению с обычными ферментными препаратами. Это возможность повторного применения, высокая стабильность, возможность использования в промышленности и медицине, возможность применения мульти-энзимных систем.

Важной особенностью радиационного синтеза является возможность использования ферментов патогенных бактерий, а также снижение аллергенности энзимных молекул.

Иммобилизация признана методом преодоления патогенности биомолекул. Преодоление патогенности биомолекул является главным преимуществом электронно-лучевой иммобилизации. Именно патогенность является свойством любого лекарственного препарата, определяющим его терапевтическую широту.

Наиболее важными видами патогенности биомолекул являются следующие.

Наиболее известной является токсичность биомолекул, обусловленная экзо- и эндотоксинами бактерий и простейших. К патогенности можно отнести провоспалительную и пирогенную активность биомолекул. С полным правом к этому типу можно отнести эндотоксины и адьюванты (фрагменты дрожжевой и грибковой стенки, не содержащие липидов полисахариды). Данный тип реализуется через выброс цитокинов (ФНО, Ил1, Ил8, Интерферонов альфа и гамма, а также липидных медиаторов повреждения – фактора активации тромбоцитов, лейкотриенов, тромбоксанов).
Другой разновидностью патогенности является аллергенность и анафилактогенность. Данной активностью обладают фрагменты биомолекул, способные индуцировать наработку специфических антител. Индукция анафилактогенности является менее понятным феноменом. Не исключено, что в развитии анафилактогенности принимает участие гиперчувствительность фагоцитов и другие механизмы (Цырендоржиев Д.Д., 1997).
Ферментная активность ксено-биомолекул может также представлять угрозу организму. Показательными могут быть яд гадюки, вызывающий активацию протеиназных каскадов крови через фактор Хаггемана, а также фосфолипаза А2, содержащаяся в яде кобры.
Мутагенность и онкогенность характерна более для олигонуклеотидов, способных разными способами встраиваться в ДНК хозяина, а также для вирусов.

В процессе создания фармакологической композиции посредством радиационного синтеза - Тромбовазим было проведено широкомасштабное исследование с целью оценки влияния иммобилизации бактериальных ферментов на их патогенность. Программа экспериментов состояла из изучения:

Хронической и острой токсичности Тромбовазима
Пирогенности, аллергогенности, а также анафилактогенности и провоспалительной активности ( влияния на генерацию активных форм кислорода, провоспалительных цитокинов).
Мутагенности и онкогенности

1. Оценка токсичности Тромбовазима

1.1. Оценка острой токсичности

Мышам препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 900 Ед/кг двукратно через 3 ч и трехкратно через 2 ч (20250 мг/кг), а внутривенно в течение 10 – 20 секунд однократно – в дозах 300, 400 и 500 Едкг

Крысам (по 3 – 5 ♀ и ♂ на дозу) препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 7500 мг/кг (100 ЕД на 100 г общей массы крысы) в максимально допустимом объеме (5 мл) и внутривенно в течение 10 – 20 с в дозах (20, 40 и 60 ЕД на 100 г общей массы крысы) в максимально допустимом объеме (2 мл).

У мышей при внутрибрюшинном введении тромбовазима быстро развивалась адинамия, одышка с участием в акте дыхания брюшных мышц. Введение препарата в дозе 20250 мг/кг привело к гибели 7 из 8 взятых в опыт мышей. Гибель животных происходила через 1-2 ч после последнего введения препарата. На основании микро и макроскопического исследования было установлено, что гибель животных произошла в результате острой сердечно-сосудистой недостаточности.

При внутрибрюшинном введении Тромбовазима в дозе 2250 Ед/кг погибли 2 из 8 взятых в опыт мышей.

При внутривенном введении препарата мышам в дозе 500 мг/кг погибло два животных «на кончике иглы». При вскрытии обнаружено выраженное полнокровие органов брюшной полости, бледный, ишемизированный мозг и запустение камер сердца. Видимо, препарат вызывает расширение просвета вен, депонирование в них крови и нарушение ее возврата к сердцу.

У крыс при внутрибрюшинном введении Тромбовазима также развивалась слабость, адинамия, одышка. Введение препарата в дозе 7500 мг/кг привело к гибели 2-х крыс через 6 и 10 ч после инъекции. Гибель крыс, как и мышей была вызвана острой сердечно-сосудистой недостаточностью.

Результаты эксперимента позволили установить параметры острой токсичности Тромбовазима для мышей и крыс при однократном внутрижелудочном и внутривенном его введении с использованием метода Литчфилда и Вилкоксона.

Таблица 8

Параметры острой токсичности (Ед/кг) Тромбовазима при однократном введении мышам и крысам (самцы + самки), Х±m

Вид животных,

Способ введения

LD₁₀

LD₅₀

LD₉₀

Мыши

Внутрибрюшинно

Внутривенно

1600±330

500±60

2650±400

610±60

4350±900

830±110

Крысы

Внутрибрюшинно

Внутривенно

900±250

1474±200

> 600

2479±600

Таким образом, на основании анализа величин параметров острой токсичности Тромбовазим относится согласно ГОСТ 12. 1. 007 – 76 к IV классу - малоопасные вещества.

1.2. Изучение токсичности Тромбовазима при многократном введении - хроническая токсичность

1.2.1. Результаты исследования на крысах

1.2.1.1.Условия эксперимента. В эксперименте использовано 82 крысы (41 самец и 41 самка). Крысы были разделены на группы. Тромбовазим животным опытных групп вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 14 дней (две недели). О токсичности испытуемых средств судили по общему состоянию, динамике общей массы при еженедельном взвешивании, картине периферической крови, костного мозга, функции печени, почек, нервной системы, сердца (ЭКГ, АД), а также данным морфологического исследования внутренних органов и их массы (головной мозг, сердце, легкое, печень, тимус, селезенка, лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт, надпочечники, половые железы, поджелудочная и щитовидная железа). Исследования проводили после окончания 14-дневного введения препарата, а также через 2 недели после его отмены.

1.2.1.2.Влияние на общее состояние и массу. Введение Тромбовазима в дозе 10, 20 и 30 ЕД/100г 14 дней ежедневно не вызывало гибели крыс. Сразу же после введения больших доз препарата животные были беспокойными и агрессивными (болевой симптом). Температуру тела крыс измеряли ректально с помощью медицинского электротермометра ТПЭМ-1. Через 14 дней введения Тромбовазима термометрия не выявила дозозависимых изменений. Средние величины температуры тела у крыс обоего пола через 14 дней введения препарата и через две недели после его отмены были выше, чем у животных контрольных групп, но в пределах значений общепринятой нормы у крыс (36,8^оС – 38,0^оС) [8]. Таким образом, ежедневное введение Тромбовазима в дозе 750, 1500 и 2250 мг/кг внутрибрюшинно в течение 14 дней не вызывало гибели животных, но отмечались дозозависимое отставание прироста общей массы, а также признаки раздражения брюшины (болевой симптом).

1.2.1.3.Влияние на показатели периферической крови. Двухнедельное внутрибрюшинное введение Тромбовазима в дозах 10, 20 и 30 ЕД/100г общей массы крыс не вызывает патологических изменений основных показателей форменных элементов периферической крови. Выявленные у крыс самок умеренные изменения со стороны содержания гемоглобина и ретикулоцитов после введения больших доз препарата носят обратимый характер.

1.2.1.4.Влияние на показатели костного мозга. Двухнедельное внутрижелудочное введение Тромбовазима в дозах 10, 20 и 30 ЕД/100г общей массы крыс не оказывает токсического влияния на показатели костного мозга крыс.

1.2.1.5.Влияние на функцию печени. Результаты экспериментальных исследований показали, что введение препарата Тромбовазим крысам в течение 14 не приводит к каким-либо нарушениям метаболизма в печени. Все изученные биохимические показатели сыворотки крови практически не отличаются от контрольных данных. Через 2 недели после отмены препарата у крыс самцов можно отметить статистически значимые по сравнению с контролем более высокие средние величины активности АсТ (во всех опытных группах), ЩФ, более низкие значения содержания глюкозы и белка, у самок наблюдается снижение уровня креатинина и холестерина. Все отмеченные изменения не являются патологическими, не имеют закономерного характера, не зависят от дозы и носят случайный характер.

Таким образом, внутрибрюшинное введение Тромбовазима крысам в дозах 10 Е/100 г, 20 Е/100 г, 30 Е/100 г массы тела в течение 2 недель не приводит к каким-либо нарушениям функционального состояния печени.

1.2.1.6.Влияние на функцию почек. Анализ проведенных исследований показал, что у животных всех опытных групп средние величины концентрации, экскреции мочевины и креатинина, наличия глюкозы, билирубина, белка, уробилиногена, нитритов, лейкоцитов, удельной плотности и рН мочи не отличаются от их контрольных значений.

1.2.1.7.Влияние на функцию ЦНС. О влиянии на ЦНС судили, исследуя эмоциональную реакцию и ориентировочно-исследовательское поведение в "открытом поле" у крыс (самцы и самки отдельно) после введения Тромбовазима в дозах 10, 20 и 30 ЕД/100г общей массы животного. При анализе полученных данных выявлено через 14 дней введения Тромбовазима в дозах 20 и 30 ЕД/100 г массы тела крыс только у самцов увеличение показателей эмоциональной реакции. Через две недели после отмены курса средние величины этого показателя нормализовались. Кроме того, имеются и другие изменения показателей эмоциональной реакции (самки, третья группа, через две недели после отмены курса) и ориентировочно-исследовательского поведения (самки, вторая группа, самцы, первая группа через две недели после отмены курса), которые носят спорадический характер.

Таким образом, двухнедельное введение Тромбовазима в дозах 10, 20 и 30 ЕД/100г общей массы крыс независимо от пола не вызывает выраженных патологических реакций изученных показателей ЦНС. При этом все же следует отметить дозозависимые изменения эмоциональной реакции у крыс-самцов, связанных очевидно с болевым синдромом.

1.2.1.8.Влияние на сердечно-сосудистую систему. О влиянии Тромбовазима на функцию сердца судили по данным электрокардиографии. При введении Тромбовазима во всех исследуемых группах, не наблюдалось нарушений сердечного ритма и проводимости. Параметры ЭКГ у крыс-самок, получавших препарат в дозах 10 Ед/100 г, 20 Ед/100 г и 30 Ед/100 (соответственно 750, 1500 и 2250 мг/кг) во все периоды наблюдения достоверно не отличались от значений в контрольной группе и не выходили за пределы принятых для данного вида животных физиологических норм, за исключением возрастания амплитуды зубца Р к моменту окончания введения препарата, что может свидетельствовать о нагрузке на правое предсердие. В группе крыс-самцов под действием препарата отмечено урежение, по сравнению с контрольной группой, частоты сердечных сокращений, как к окончанию введения Тромбовазима так и через 2 недели после его отмены. Причем у животных, получавших Тромбовазим в дозах 10 Ед/100 г и 30 Ед/100 г, снижение ЧСС достигло уровня статистической значимости. Достоверных сдвигов других показателей ЭКГ не наблюдалось. У животных всех исследуемых групп, т.е. независимо от дозы Тромбовазима и пола животных, не отмечено значимых изменений средних величин системного артериального давления по сравнению с контрольными.

Таким образом, Тромбовазим при курсовом введении в дозах 10 Ед/100 г, 20 Ед/100 г и 30 Ед/100 г не оказывает существенного токсического влияния на электрическую активность сердца крыс. Тромбовазим при длительном введении в различных дозах, не изменяет системного артериального давления у крыс.

1.2.2. Патоморфологическое исследование хронической токсичности

Патоморфологическое исследование хронической токсичности Тромбовазима на крысах. Патоморфологическое исследование внутренних органов крыс, получавших Тромбовазим внутрибрюшинно в дозах 10, 20 и 30 ЕД/100 г в течение 14 дней, не выявило каких-либо патологических изменений. Препарат обладает раздражающим действием на брюшину, что проявляется в воспалительных изменениях серозных оболочек желудка и кишечника, капсулы селезенки и капсулы и междольковых прослоек поджелудочной железы в силу ее анатомического строения у крыс.

1 2.3. О местнораздражающем действии Тромбовазима

Внутривенное введение Тромбовазима собакам в дозе 20 ЕД/кг в течение 14 дней не обладает раздражающим действием на сосудистую стенку.

1.2.4. Оценка хронической токсичности при внутривенном введении Тромбовазима собакам

Эксперименты проведены на половозрелых неинбредных собаках в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986), а также в соответствии с методическими указаниями по изучению токсического действия фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному /доклиническому/ изучению новых фармакологических веществ. М., 2000 г.) [7]. Полученные цифровые материалы обрабатывали статистически с применением критерия Стьюдента и Вилкоксона-Мана-Уитни [1].

1.2.4.1.Условия эксперимента. Хроническая токсичность Тромбовазима изучена на 4 собаках. Препарат в дозе 20 ЕД/кг вводили животным внутривенно капельно (60 капель в мин) в разведении из расчета: 20 ЕД в 5 мл физиологического раствора ежедневно в течение 14 дней. Проводили наблюдения за общим состоянием и массой тела собак, исследовали показатели периферической крови, биохимию крови.

Собаки введение Тромбовазима переносили хорошо, были подвижны, не агрессивны, имели хороший аппетит, были опрятны. Масса животных за период наблюдения или существенно не изменялась или возросла на 1 - 3 кг.

1.2.4.2.Влияние на показатели периферической крови и костного мозга. Кровь для общего анализа брали путем пункции из бедренной вены и определяли содержание гемоглобина, эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и их цитограмму, а также СОЭ [3, 6, 8]. и осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ, интенсивность гемолиза,) методом изучения гипертонической устойчивости клеток. Кровь исследовали у собак до и через 14 дней после введения Тромбовазима (табл. 9).

Как следует из табл. 9 средние величины изученных показателей периферической крови у собак, в течение 14 дней получавших препарат в дозе 20 ЕД/кг, статистически достоверно в основном не разнились с таковыми до его введения.

Таблица 9

Показатели (X±m) периферической крови у собак до и через две недели ежедневного введения Тромбовазима

Показатели	До введения	После введения	Р
Эритроциты, Т/л	6,50±0,31	6,58±0,18	> 0,05
Гематокрит, %	41,4±2,7	40,0±1,1	> 0,05
Ретикулоциты, ‰	8,3±0,6	5,8±1,4	> 0,05
О.Р.Э., у. е.	1,49±0,09	1,02±0,03*	< 0,05
Тромбоциты, Г/л	214,5±32,2	264,7±80,3	> 0,05
Гемоглобин, г/л	138,8±8,	130,8±3,7	> 0,05
Лейкоциты, Г/л	26,0±5,7	16,8±2,6	> 0,05
Эозинофилы, %	4,62±2,32	4,75±0,78	> 0,05
Нейтрофилы, п/я, %	4,88±1,99	2,75±0,85	> 0,05
Нейтрофилы, с/я, %	74,62±2,70	69,63±1,14	> 0,05
Лимфоциты, %	9,38±0,80	14,13±2,44	> 0,05
Моноциты, %	6,50±1,65	8,62±2,16	> 0,05
СОЭ, мм/ч	5,0±2,3	7,0±2,9	> 0,05
Масса, кг	19,0±3,2	20,8±3,3	> 0,05

Таким образом, введение Тромбовазима собакам внутривенно капельно в дозе 20 ЕД/кг в течение 14 дней не оказывает токсического влияния на показатели периферической крови и костного мозга.

1.2.4.3.Влияние на биохимические показатели сыворотки крови. Результаты проведенных исследований (табл. 4) показали, что внутривенное введение собакам препарата Тромбовазим (доза 20 ЕД/кг) в течение 14 дней не приводит к изменениям средних величин биохимических показателей сыворотки крови при сравнении с их исходными данными (табл. 5).

Таблица 10

Биохимические показатели сыворотки крови собак (Х±m) до и через 2 недели ежедневного введения Тромбовазима

Показатели	До введения	После введения	Р
АлТ, мкмоль/мл	1,35±0,48	1,04±1,10	> 0,05
АсТ, мкмоль/мл	0,38±0,23	0,81±0,16	> 0,05
Глюкоза ммоль/л	5,23±0,69	6,36±1,27	> 0,05
ЩФ, Е/л	130,50±58,01	138,46±56,05	> 0,05
Креатинин, мкмоль/л	125,89±7,24	103,74±8,85	> 0,05
Белок, г/л	65,09±7,00	69,49±3,54	> 0,05
Холестерин, ммоль/л	6,08±0,67	5,22±0,22	> 0,05
Билирубин, мкмоль/л	3,23±1,40	6,16±1,54	> 0,05
Мочевина, ммоль/л	4,58±0,54	5,81±0,89	> 0,05

1.3. Заключение по исследованию токсичности

На мышах, крысах (самцы и самки) и собаках исследовано влияние внутрижелудочного (через зонд) и внутривенного (капельно) введения лекарственного средства Тромбовазим при однократном (острая токсичность) и многократном (хроническая токсичность - в дозе 10, 20 и 30 ЕД на 100 г общей массы крыс и в дозе 20 ЕД на кг массы собак в течение 14 суток ежедневно) введении на общее состояние, выживание, массу животных, показатели периферической крови и костного мозга, сердечно-сосудистую, центральную нервную системы, функциональное состояние печени и почек, массу и морфологию внутренних органов.

Исследование хронической токсичности показало, что на функциональное состояние изученных внутренних органов и систем препарат не оказывает токсического влияния. Макро- и микроскопическое исследование внутренних органов лабораторных животных также не выявило патологических проявлений многократного введения препарата в различных дозах.

Препарат не вызывал драматической активации свертывающей и фибринолитических систем, о чем свидетельствует умеренное, в пределах 40% от нормы, снижение фибриногена и циркулирующих тромбоцитов.

Препарат обладает раздражающим действием на брюшину, что проявляется в воспалительных изменениях серозных оболочек желудка и кишечника, капсулы селезенки и капсулы и междольковых прослоек поджелудочной железы в силу ее анатомического строения у крыс. Внутривенное введение Тромбовазима собакам в дозе 20 ЕД/кг в течение 14 дней не обладает раздражающим действием на сосудистую стенку.

Использованные в хроническом эксперименте дозы Тромбовазима на крысах превышают таковые для человека (на кг массы) в 40 - 100 раз, на собаках в 3 – 4 раза.

Результаты эксперимента позволили установить параметры острой токсичности Тромбовазима для мышей и крыс (табл. 3 и 4) при однократном внутрижелудочном и внутривенном его введении с использованием метода Литчфилда и Вилкоксона [1].

Таким образом, на основании анализа величин параметров острой токсичности Тромбовазим относится согласно ГОСТ 12. 1. 007 – 76 к 4 классу (малоопасные вещества) [11].

На основании проведенных исследований можно также сделать вывод, что метод электронно-лучевой иммобилизации ксено-биомолекул на водорастворимых полимерах (в данном случае, на полиэтиленсоксде) является эффективным методом преодоления некоторых видов патогенности этих биомолекул.

Глава 2. КРАТКИЙ ОБЗОР ПРОВЕДЕННЫХ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ ПРЕПАРАТ ТРОМБОВАЗИМ ПАРЭНТЕРАЛЬНАЯ (ВНУТРИВЕННАЯ) И ЭНТЕРАЛЬНАЯ ФОРМЫ.

Доклинические испытания Тромбовазима (парэнтеральная форма) проводились в:

Институт фармакологии СО РАМН (Томск)
Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск)
НИИ биологии и биофизики (Томск)
Федеральный академический центр гемостаза (Барнаул)
Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (Новосибирск)
Институт физиологии СО РАМН (Новосибирск)
Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (Новосибирск)

2.1. Фибринолитическое и антитромботическое действие действия препарата Тромбовазим in vitro

n Оценка эффектов Тромбовазима была выполнена на пуле плазмы, полученной при смешивании равных объемов образцов бедной тромбоцитами плазмы, стабилизированной цитратом венозной крови здоровых добровольцев в возрасте 19-35 лет.

n В экспериментах «in vitro»выявлено прямое дозо-зависимое фибринолитическое действие препарата на сгусток фибрина, полученного из очищенного фибрин-мономера. Механизм действия отличен от действия плазмина, поскольку данный препарат не разрушает лизиновые связи специфичного хромогенного субстрата.

n Препарат не вызывает активацию плазминогена, напротив, концентрация плазминогена в плазме увеличивается на 40%.

n Препарат препятствует полимеризации фибрин-мономеров. По существу, это антитромботическое действие тромбовазима, не имеющее аналогов среди известных лекарственных препаратов. Действие связано с действием субтилизинов, так как инактивация фермента сопровождалась исчезновением этого эффекта

n Тромбовазим на 40% снижал АДФ- индуцированную адгезию тромбоцитов in vitro и увеличивал скорость лизиса эуглобулинового сгустка при внутривенном введении. Результаты представлены в Табл.1 и Табл. 2

2.2. Исследование тромболитической и антитромботической активности in vivo при внутривенном введении проведено на крысах-самцах линии Вистар массой 220-240 г. Кровоток в сонных артериях измеряли с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 и MFV-2100 (Nihon Kohden, Япония) с графической регистрацией. Моделирование тромбоза проводили с использованием железа (II) хлорида. Ватный тампон массой 1,5 мг смачивали до полного пропитывания в 10% растворе хлорида железа и накладывали на общую сонную артерию. Через 15 мин ватный тампон убирали и трехкратно промывали операционное поле физиологическим раствором.

Тромбовазим вводили в дозе 20 ЕД на крысу внутрибрюшинно за 30 минут до аппликации железа(II) хлорида, или сразу после удаления хлорида железа. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество физиологического раствора.

n Профилактическое введение Тромбовазима эффективно ограничивает процесс тромбообразования в сонной артерии в первые 1,5 часа после воздействии на нее хлоридом двухвалентного железа. На фоне введения Тромбовазима доля животных с полной окклюзией сонной артерии к 90 минуте составила 20%, что достоверно ниже, чем в контрольной группе (78%).

n При терапевтическом введении Тромбовазима через 24 часа достоверно и существенно (в 3 раза) снижается доля животных с полной окклюзией сонной артерии. При наличие остаточного тромба в сонной артерии масса тромба была в среднем в 3 раза меньше по сравнению с группой контроля

2.3. Исследование тромболитической активности Тромбовазима при приеме per os

n Тромбовазим вводили внутрижелудочно. Первое
введение проводили за 4 ч до аппликации FeCl2, второе - через 2 ч после. В последующий период Тромбовазим вводили дважды в сутки. Животные контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды.

n Масса тромбов у крыс на фоне терапии Тромбовазимом была достоверно меньше (на 25%) величины показателя в контроле. Кровоток в контрольной группе крыс в этот период составил 6,6±0,9 мл/мин и 0,6±0,6 мл/мин соответственно по правой и левой сонным артериям. В опытной группе кровоток составил 7,2±1,0 мл/мин и 3,1±1,2 мл/мин соответственно по правой и левой общим сонным артериям. Различия по группам достоверны. Результаты представлены в Табл 1.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о выраженной тромболитической и антитромботической активности препарата in vitro, а также при лечебном и профилактическом применении.

2.4. Противовоспалительный эффект Тромбовазима

Данный показан в стандартных фармакологических моделях Выявлена антипролиферативная активность исследуемого препарата на фоне развивающихся пролиферативных процессов у крыс с имплантированной «ватной» гранулемой. Противовоспалительное и антиэкссудативное действие наблюдалось при профилактическом и лечебном введении тромбовазима крысам с артритом, вызванным адъювантом Фрейнда.

n Противовоспалительный эффект связан с влиянием Тромбовазима на окислительную функцию нейтрофилов крови, макрофагов легких и перитонеальной полости. Окислительно- метаболическую активность клеток оценивали с помощью биохемилюминометра «СКИФ-0301» по спонтанному и зимозан-индуцированному ХЛ ответу по методу Tono-oka T. еt al. (1983).

Добавление различных концентраций (сопоставимых с используемыми в клинике) Тромбовазима дозо-зависимо снижает способность фагоцитов генерировать активные метаболиты кислорода как спонтанно, так и после стимуляции зимозаном.

n Противовоспалительный эффект связан также с влиянием Тромбовазима на продукцию провоспалительных цитокинов.

Активность ФНО в сыворотке и супернатанте оценивалась с помощью метода описанного G. Evans и соавт (1989). Эксперименты in vitro проводились на легочных макрофагах. Введение в/в Тромбовазима в дозе 30 Ед/кг через 1 мин после введения эндотоксина снижает продукцию способность фагоцитов генерировать ФНО в 50 раз как in vitro, так и in vivo. Таким образом, Тромбовазим способен влиять на окислительно-метаболическую и цитокин-продуцирующую функции фагоцитирующих клеток.

2.5. Кардиопротективное действие оценивалось на адреналиновой модели инфаркта миокарда. Сравнение результатов показало, что после развития адреналинового миокардита внутрибрюшинное введение Тромбовазима достоверно снижает количество некрозов в сердечной мышце к концу 3-х суток по сравнению с контролем - в 1,5 раза (p<0,05). При этом дистрофические изменения в сердечной мышце при введении Тромбовазима лекарственных средств к концу 7-х суток так же были выражены достоверно (в 2,5 раза (p<0,02)) меньше, чем в контрольной группе.

2.6. Фармакокинетика:

n При внутривенном введении общий клиренс препарата (С_D) 1,2 мл/мин. Константа скорости элиминации при однократном введении (K_EL) «Тромбовазима» составляет 0,057 мин^-1. При однократном внутривенном введении период полувыведения (T_1/2) «Тромбовазима», при измерении специфической активности препарата в крови, составляет 12 минут. Основной путь выведения препарат через почки. Препарат выводится почками в активном виде с сохранением специфической активности, определяемой по гидролизу хромогенных белковых субстратов. Частично «Тромбовазим» метаболизируется и выводится печенью. Связывания «Тромбовазима»с белками плазмы и форменными элементами крови не установлено. При нарушении функции почек возможно увеличение периода полувыведения «Тромбовазима». Препарат не обладает кумулятивным действием при соблюдении рекомендуемых доз и кратности введения, которые учитывают период полувыведения и другие фармакокинетические показатели.

n Фармакокинетические параметры Тромбовазима при энтеральном введении представлены в Табл. 5. Биодоступность препарата около 20%, время достижения пиковой концентрации 5 ч, время полувыведения 0.43 ч.

На основании проведенных доклинических исследований можно сделать вывод, что клиническими значимыми являются следующие механизмы действия:

Тромболитический, связанный с непосредственным воздействием на фибрин и клеточную массу тромба
Антитромботический, связанный с препятствием полимеризации фибрина и снижением адгезии тромбоцитов
Противовоспалительный
Кардиопротективный

Таким образом, на основании доклинических исследований можно сделать вывод, что препарат относится к разряду низкотоксичных, гипоаллергенных, может использоваться повторно, или непрерывно в течение как минимум 14 дней. При энтеральном введении не выявлено ульцерогенных и раздражающих свойств. Не отмечалось также поведенческих рекций в ответ на внутривенное и внутрижелудочное введение.

Таблица 1

Влияние трехминутной инкубации Тромбовазима в плазме на агрегацию тромбоцитов, вызванную индуктором агрегации АДФ (1^.10^{-6 М)}

Контроль

(n=11 )

Тромбовазим, ПЕ/мл

0,1

(n=5)

0,2

(n=6)

0,3

(n=5)

0,4

(n=5)

0,5

(n=9)

1,0

(n=7)

32±2

19±1*

24±1*

26±1*

33±1

34±1

31±1

Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с контролем

Таблица 2

Влияние Тромбовазима (10 ПЕ/кг внутривенно и 70 ПЕ/кг внутрибрюшинно) на время спонтанного эуглобулинового фибринолиза и концентрацию плазминогена у крыс

Группа	Спонтанный эуглобулиновый фибринолиз, мин	Концентрация плазминогена, %
Физиологический раствор, n=8	229±17	100±6
Тромбовазим, n=10	162±23*	141±17*

Таблица 3

Влияние лечебно-профилактического внутрижелудочного введения Тромбовазима на кровоток по общим сонным артериям через 48 ч после тромбоза, вызванного FeCl₂ у крыс

Показатель	Контроль, (n=7)	Тромбовазим, (n=7)
Кровоток по правой сонной артерии, мл/мин	6,6±0,9	7,2±1,0
Кровоток по левой сонной артерии, мл/мин	0,6±0,6	3,1±1,2*
Количество крыс с полной окклюзией сонной артерии, %	86	43*
Количество крыс с тромбом сонной артерии, %	86	71
Масса тромба, мг (у животных с тромбом)	0,89±0,05	0,67±0,09*

Примечание: * - P<0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 4

Параметры острой токсичности (Ед/кг) Тромбовазима при однократном введении мышам и крысам (самцы + самки), Х±m

Вид животных,

способ введения

LD₁₀

LD₅₀

LD₉₀

Мыши

Внутрибрюшинно

Внутривенно

9687,7

±2003,8

2883,8

±378,6

15917,3

±2435,0

3797,2

±370,6

26152,8

±5409,4

5000,0

±656,5

Крысы

Внутрибрюшинно

Внутривенно

5556,3±1414,1

8844,7

±1122,3

> 3750

14879,4

±3583,3

Таблица 5

Фармакокинетические параметры Тромбовазима при внутрижелудочном введении

Параметры	Значения
AUC, ЕД·ч/мл (нулевой момент)	0,132
AUMC, ЕД·ч²/мл (первый момент)	0,640
AUMMC, ЕД·ч³/мл (второй момент)	0,778
Т_max, ч(время достижения максимальной концентрации)	5
С_max, Ед/мл(максимальная концентрация)	0,044
Cl_ро, мл/ч (клиренс)	6,792
K_el, 1/ч (константа элиминации)	5,319
T_1/2, ч (период полувыведения)	0,43
MRT_ро, ч (среднее время удержания)	4,832
V_pо, л (объем распределения)	1,277
F (доля всосавшегося препарата)	0,17

Глава 3 Результаты II фазы клинических исследований «Рокит-ВН» по протоколу № 03-04 «Открытое рандомизированное исследование нового лекарственного средства ТРОМБОВАЗИМ для лечения хронической венозной недостаточности»

1. Формальные данные исследований

Клинические исследования «Рокит-ВН» проводились по разрешению Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 257 от 12 июля 2005 года.

Клинические исследования проведены в полном объёме. В исследовании приняли участие 62 больных хронической венозной недостаточностью.

Клинические центры:

1. ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск

2. МУЗ Городская клиническая больница № 12, Новосибирск

3. Некоммерческая организация, фонд развития и оказания специализированной медицинской помощи «Медсанчасть-168», Новосибирск

Клинические исследования «Рокит-ВН» проводились по Правилам GCP в соответствии с действующими нормативными требованиями (ОСТ 42-511-99 от 01.01.99 г., Приказ Минздрава РФ №266 от 19.06.2003 г.), по Протоколу «Открытое рандомизированное исследование нового лекарственного средства ТРОМБОВАЗИМ для лечения хронической венозной недостаточности».

2. Цель и задачи исследования

2.1. Цель исследования

Во II фазе клинических исследований ставилась задача изучить эффективность и безопасность терапии Тромбовазимом у больных хронической венозной недостаточностью.

2.2. Задачи исследования

1) Оценить изменения степени венозной недостаточности при 14-дневном курсе лечения Тромбовазимом по данным объективного и клинического обследования в день поступления и на 15-й день после начала лечения;

2) Оценить частоту и выраженность геморрагических осложнений;

3) Изучить влияние Тромбовазима на показатели гемостаза

3. Краткая характеристика лекарственного средства Тромбовазим

Тромбовазим – плоскоцилиндрические таблетки с фаской и одной риской, слабо-желтого цвета, допускается мраморность, с гладкой поверхностью, диаметром 12 мм.

Состав препарата: таблетка 600 мг содержит высокоочищенный ферментный препарат, получаемый в результате иммобилизации на полиэтиленоксиде протеиназ, продуцируемых Bacillus subtilis – 200 ЕД (0,080 г). Вспомогательные вещества: декстран, 30 кДа (0,080 г), крахмал картофельный (0,348 г), целлюлоза микрокристаллическая «МКЦ-П» (0,090 г), натрий хлорид (0,009 г), кальция стеарат (0,003 г).

Фармакологическая группа: Тромбовазим относится к группе лекарственных средств, действующих на сердечно-сосудистую систему. Он может быть отнесён одновременно к двум подгруппам:

а) средства, ингибирующие и стимулирующие систему свёртывания;

б) средства, улучшающие кровоснабжение органов и тканей в подразделе – средства, улучшающие кровоснабжение и метаболизм тканей.

Фармакологические свойства: ферментный препарат с выраженным тромболитическим действием. Тромболитический эффект носит прямой характер и связан с прямой деструкцией нитей фибрина образующих основной каркас тромбов. Терапевтические дозы препарата обеспечивают лизис тромбов. Кроме того, Тромбовазим обладает противовоспалительным и цитопротективным действием. Препарат также эффективен в качестве профилактического средства при угрозе развития венозных или артериальных тромбозов.

Способ введения: Согласно протокола исследования Тромбовазим вводился per os. Продолжительность лечения 14 дней. Максимальная разовая доза – 8 таблеток. Максимальная суточная доза 10 таблеток. Максимальная курсовая доза не превышала 28 000 ЕД.

4. Отбор больных

4.1. Условия отбора

Вид исследования – открытое рандомизированное с использованием метода параллельных групп. Группа наблюдения и группа сравнения формировались параллельно в одни и те же сроки случайным образом. Рандомизация обеспечивалась методом случайных чисел, при котором каждый порядковый номер был случайным образом отнесён к 1-й или 2-й группе. После подписания информированного соглашения пациентом, удовлетворяющим всем критериям включения, ему присваивался порядковый номер, который исходно определял группу включения:

1-я - группа сравнения – лечение тромбовазимом, n= 33

2-я – группа наблюдения – лечение троксевазином, n= 29

4.2. Критерии включения.

Для участия в исследовании отбирались пациенты 40-75 лет мужского и женского пола с хронической венозной недостаточностью, (III-VI степень по международной классификации СЕАР) с отёками, экземой, гиперпигментацией, трофическими нарушениями кожи.

Включение пациента в исследование осуществлялось после подписания им информированного согласия.

4.3. Критерии исключения.

а). Активное кровотечение или геморрагический диатез в анамнезе в течение предыдущих 3-х месяцев;

б). Инсульт в анамнезе, деменция или повреждение центральной нервной системы (опухоль, аневризма, внутричерепная или интраспинальная хирургическая операция или травма) за последние 3 месяца;

в). Фибрилляция или трепетание предсердий на момент рандомизации;

г). ХСН III-IV ст. по NYHA¹³;

д). Хроническое легочное сердце;

е). Декомпенсированные заболевания эндокринных органов;

ж). Тяжёлая печёночная или почечная недостаточность (билирубин>80 ммоль/л, креатинин >200 ммоль/л);

з). Поливалентная лекарственная аллергия;

и). Онкологические заболевания;

к). Инфицированные язвы нижних конечностей; требующие назначения антибактериальной терапии;

л). Беременность и лактация.

4.4. Критерии выбытия или критерии прекращения введения Тромбовазима в ходе исследования:

а). Отказ больного от продолжения участия в клинических исследованиях;

б). Тяжёлые и опасные кровотечения или серьёзные осложнения при введении Тромбовазима, при этом полученные результаты включаются в статистическую обработку;

в). Выявление врачом неоправданно высокого риска для больного;

г). Проведение экстренного оперативного вмешательства, или любая другая причина, требующая прекращения клинического исследования. При этом полученные результаты включаются в статистическую обработку.

По вышеперечисленным критериям выбывших больных не было.

5. Контингенты и методы исследования

5.1. Случаи, не включённые в анализ

В группу наблюдения (Тромбовазим) было включено 33 больных хронической венозной недостаточностью. Эти пациенты принимали Тромбовазим сразу после рандомизации. В группе контроля (29 пациентов) в качестве препарата сравнения был использован Троксевазин в дозе 600 мг в сутки. Анализ побочных эффектов и осложнений проведен у всех больных, которые принимали Тромбовазим и Троксевазин.

Перед анализом эффективности ряд случаев исключили (приложение № 3). Из группы наблюдения был исключён 1 пациент по причине нарушения режима приёма препарата. По причине несоответствия критериям включения в анализ эффективности не были включены 3 человека из группы контроля (превышение возрастного порога).

Таким образом, анализ эффективности проведён на группе наблюдения 32 больных, группа контроля – 26 человек.

5.2. Методы статистического исследования и контролируемые параметры.

Обработку данных и сравнение переменных проводили соответствующими статистическими методами с предварительной проверкой на соответствие вариабельности признаков нормальному распределению, которое оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. При условии нормального распределения использовали критерий Стьюдента. Динамику показателей в группе определяли методом попарно связанных вариант с использованием критерия Стьюдента при нормальном распределении показателей и с использованием критерия Вилкоксона (Wilcoxon) при несоответствии нормальному распределению. Сравнение показателей между группами при условии нормального распределения проводили с использованием критерия Стьюдента. При условии ненормального распределения показателя сравнение между группами проводили непараметрическими методами с использованием критерия Манн-Уитни (Mann-Whitney). Сопоставление по качественным признакам (пол, степень СЕАР, и другие) проводили, используя критерии Пирсона (Pearson) и Фишера (Fisher). Во всех случаях использовали 95% уровень значимости. При статистической обработке данных пользовались рекомендациями С. Гланца¹⁵.

6. Результаты

6.1. Сопоставимость групп наблюдения и контроля

Сопоставимость групп анализировали с учётом влияния факторов на оценку клинической эффективности лечения. По половозрастному составу и антропометрическим данным группы между собой не различались. В обеих группах было больше женщин: 75 % в группе наблюдения (Тромбовазим) и 77 % в группе сравнения (табл. 2).

Таблица 2.

Половозрастная и антропометрическая характеристика групп

Тромбовазим

Троксевазин

Встречаемость женщин, %

Средний возраст, лет

Индекс Кетле, кг/м²

75 %

58,8 ± 8,4

32,8 ± 7,1

77 %

62,6 ± 7,2

32,2 ± 7,9

Результаты сопоставления по качественным клиническим признакам представлены в таблице 3. В группу с Тромбовазимом случайным образом набралось меньше больных с 3-й стадией и больше больных с 6-й стадией ХВН (рис. 1), однако различия были не достоверными.

Рис. 1. Встречаемость различных стадий ХВН в группе

наблюдения и группе сравнения.

Сахарный диабет в обеих группах был достаточно распространённым явлением. Его встречаемость в группе сравнения была несколько выше, однако различие было недостоверным. По степени выраженности клинических симптомов (балльная шкала СЕАР) группы также не различались. В группе наблюдения (Тромбовазим) средний балл составил 5,50, а в группе сравнения – 5,34. В обеих группах встречаемость трофических язв была также на одном уровне. При этом средняя площадь трофических язв была практически одинаковой – в группе Тромбовазима 2,31 ± 0,75 см², а в группе cравнения – 2,40 ± 0,96 см².

Таблица 3.

Встречаемость качественных признаков в исследуемых группах.

Показатель

Тромбовазим

n=32

Троксевазин

n=26

p (Pearson)

Стадии ХВН

· 3

· 4

· 5

· 6

p>0,1

Сахарный диабет

· Есть

· Нет

p>0,1

ПТФС:

· Есть

· Нет

p>0,1

Трофические язвы:

· Есть

· Нет

p>0,1

Экзема:

· Есть

· Нет

p>0,1

Гиперпигментация:

· Есть

· Нет

p>0,1

Состояние венозного и лимфооттока определялось реолимфовазографией¹⁸, лазерной доплеровской флоуметрией^6,7,8. Кроме того, с целью оценки дренажной функции лимфовенозного русла, а также для оценки эффективности лечения факультативно проводилась лимфосцинтиграфия¹⁷. В обеих группах функциональные нарушения были выражены в одинаковой степени (табл. 4).

Таблица 4.

Исходные показатели венозного кровотока и лимфоотока, М±SD

Показатель	Тромбовазим	Троксевазин	Достоверность различия, р
Реолимфовазография
Vel _ло, Ом/сек </